Food Funct. | 中南大学湘雅公共卫生学院陈继华团队解锁叶酸抗骨质流失新密码

文章标题：Folic acid supplementation prevents high body fat-induced bone loss through TGR5 signaling pathways

发表期刊：Food & Function

影响因子：5.1

作者单位：中南大学湘雅公共卫生学院

百趣提供服务：16S测序、新一代代谢组学NGM 2

骨质疏松症是由骨质流失引起的一种常见的全身性骨病，可导致骨骼脆弱，增加骨折风险，已成为一个重要的全球公共卫生问题。叶酸是一种B族维生素，具有调节脂质代谢和抗氧化能力等功能，但叶酸在骨质流失中的独立作用仍然存在争议。本文通过分析肠道菌群组成、代谢特征以及TGR5相关信号通路的变化，探讨叶酸补充对骨质流失影响的可能机制，为预防骨质流失和骨质疏松提供新思路和实验依据。

1.叶酸摄入量和总骨密度之间的关系可能由体脂率介导

利用2011-2018年NHANES人口数据分析叶酸摄入量与骨密度的关系。在排除了年龄小于20岁的人群并筛选了相关变量缺失较多的样本后，最终样本量为7551例（图1B）。广义非线性模型分析发现，叶酸摄入量每增加1 mg，总骨密度增加约0.007 g/cm²，由此推测出叶酸摄入量可能会影响总骨密度，从而影响骨骼健康。本文进一步分析了体脂率作为叶酸与骨密度(Bone Mineral Density, BMD)作用的中介因子，其中介效应占总效应的82.7%（图1C）。因此，作者推测叶酸可能通过影响体脂率来影响骨骼健康。

为探索叶酸对体脂的影响，将小鼠分为四组（图2A），分别是正常饮食组、正常饮食+叶酸组、高脂饮食组、高脂饮食+叶酸组。通过高脂饮食构建体脂率高的小鼠模型，并通过在饮用水中添加叶酸对相应组别小鼠进行干预。结果显示，体脂率高的小鼠体重增加了2倍，体脂率增加了3.6倍。补充叶酸后，体重没有显著变化，体脂率下降了27%（图2）。同时，体脂率高的小鼠血脂指标异常，补充叶酸能改善血脂异常。其中，总胆固醇(Total Cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglycerides, TG)和低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)表现出与体脂率相同的趋势（图2D–G）。在体脂率正常的小鼠中，补充叶酸后未观察到明显异常现象。

3.补充叶酸可改善高体脂小鼠的骨质流失

微CT扫描和三维重建结果显示高体脂率老鼠的股骨表现出明显的骨破坏，而叶酸改善了骨质量（图3A）；通过微CT计算的骨矿物质含量(Bone Mineral Content, BMC)也显示出同样的趋势（图3F）。小鼠股骨的HE染色显示，高体脂率小鼠的骨小梁数量和体积减少，而补充叶酸使骨小梁数量和体积增加（图3B）。小鼠股骨的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphase, TRAP)染色显示，高体脂率小鼠的破骨细胞数量增加，而补充叶酸减少了破骨细胞数量（图3C）。同时，骨形成标志物PINP和成骨标记蛋白RUNX2的变化趋势与HE染色相同，骨吸收标志物CTX-1和破骨细胞标志物蛋白CTSK的变化趋势与TRAP染色相同（图3D、E、G）。

4.补充叶酸对肠道菌群组成的影响

小鼠粪便16S rRNA测序结果显示不同组小鼠的肠道菌群组成存在显著差异（图4A-C）。维恩图分析发现，四组小鼠之间存在5种差异肠道菌群（图4D）。其中，嗜胆菌属和玫瑰属与能量代谢、脂质代谢、胆汁酸代谢密切相关。这表明补充叶酸可以改善肠道菌群的失衡，从而调节体内的新陈代谢。

5.补充叶酸对血清代谢物组成的影响

血清代谢组学分析表明，不同组间小鼠的代谢物存在显著差异（图5A）。维恩图分析显示，四组小鼠体内存在112种差异代谢物（图5B）。对这112种差异代谢物的KEGG通路分析表明，它们参与了相关的代谢通路，包括蝶呤生物合成和胆汁酸生物合成（图5C）。对参与相关代谢途径的22种差异代谢物进行聚类热图分析，发现这些代谢物在四组间差异显著，表明补充叶酸改善了高脂肪对这些代谢物的影响（图5D）。

6.肠道菌群与代谢产物的相关性分析及机制推测

为了深入探究补充叶酸影响骨质流失的潜在机制，研究人员进行了肠道菌群与代谢产物的相关性分析，分别提取叶酸摄入量、体脂率(Body Fat Rate, BFR)和BMC进行网络相关性分析，发现石胆酸(Lithocholic Acid, LCA)可能是叶酸摄入量与BFR之间的桥梁，进而影响BMC（图6）。结合肠道菌群和代谢物分析的结果，推测胆汁酸代谢可能在这个过程中起重要作用。

本文研究发现，补充叶酸会影响体脂率高小鼠的LCA代谢水平（图7B）。因此，本文推测补充叶酸可能通过影响LCA代谢，然后影响TGR5相关信号通路来改善骨质流失（图7A）。小鼠股骨石蜡切片多色免疫组化结果显示，高体脂率小鼠TGR5和RUNX2表达降低，CTSK表达升高。补充叶酸增加了TGR5和RUNX2的表达，降低了CTSK的表达（图7C）。同时，本文检测了TGR5和下游信号通路蛋白在小鼠股骨中的表达。体脂率高的小鼠TGR5表达降低，ERK和AMPK的磷酸化减弱，NF-κB的磷酸化升高。补充叶酸可逆转这些蛋白质的表达（图7D）。因此，补充叶酸可能通过调节LCA，进而调节TGR5及其下游途径来改善骨质流失。

在20-60岁的人群中，叶酸摄入量与全身骨密度呈正相关，其影响可能由体脂率介导。同时，补充叶酸可有效减少高体脂率小鼠的骨质流失，主要通过调节脂质代谢，改善体内肠道菌群失衡和代谢紊乱。最明显的是补充叶酸调节LCA的代谢，激活TGR5和下游信号通路，影响小鼠的骨形成和吸收过程，从而改善高体脂率小鼠的骨质流失。